Mykobakterier standardundersøgelse (mikroskopi, én PCR, dyrkning, evt. identifikation, evt. resistensbestemmelse) (R-nr. 9100)

Indikation

Primær diagnostik: Ved formodning om sygdom forårsaget af mykobakterier, dels Mycobacterium tuberculosis kompleks (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, m.fl.), dels såkaldte "atypiske" / "non-tuberkuløse" mykobakterier.

Standardundersøgelsen indeholder mikroskopi og dyrkning for mykobakterier. Herudover udføres, som led i standardundersøgelsen, én PCR for M. tuberculosis kompleks ved nye tilfælde, dvs. hvor der ikke foreligger andre mykobakterieundersøgelser indenfor det seneste år. Denne PCR for M. tuberculosis kompleks indeholder genotypisk resistensbestemmelse for isoniazid og rifampicin. Hvis en prøve bliver mikroskopi positiv og PCR negativ for M. tuberculosis kompleks, laves PCR for atypiske mykobakterier. Formalinfikseret, paraffinindstøbt væv kan ikke dyrkes, se nedenfor.

Vedr. dyreprøver, se punktet "Prøvemateriale", tidspunkt og evt. prøvetagning” nedenfor.

Prøvemateriale, tidspunkt og evt. prøvetagning

DYREPRØVER / ISOLATER
Prøve og rekvisition skal forsynes med sporbar, unik identitetskode for dyret. Prøvetagning, mængde, beholder og forsendelse tillempes nedenstående humane anbefalinger. Bemærk; hvis der fremsendes isolater fra dyr (eller undtagelsesvist non-tuberkuløse mykobakterier mennesker), så udføres der ”standardundersøgelse” (R-nr. 9100), og ved påvisning af mykobakterier udføres speciesbestemmelse.

ANBEFALET PRØVEMATERIALE - GENERELT
Send så meget prøvemateriale som praktisk muligt i hver beholder. Tag gerne flere prøver. Podepinde anbefales ikke, da de indeholder for lidt prøvemateriale. Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit, da det dræber bakterier og ødelægger analysen.

BLOD OG KNOGLEMARV
Prøvemængde: Blod: 10 mL. Knoglemarv: Så meget som muligt.
Prøvebeholder: Hepariniseret blodprøveglas. Transporttiden skal være så kort som mulig. Opbevares ved stuetemperatur eller 35-37 °C indtil afsendelse.
Bemærkninger: EDTA som antikoagulant bør ikke anvendes, da det selv i små mængder hæmmer væksten af mykobakterier. Undersøgelse af blod og knoglemarv er relevant ved mistanke om miliær TB eller dissemineret infektion med andre mykobakterier.

EKSSUDAT FRA SERØS HULHED
Prøvemateriale: Pleura-, perikardie-, ascites- eller ledvæske.
Prøvemængde: Så meget som muligt (helst 10-15 mL). Muligheden for at påvise mykobakterier stiger med prøvemængden.
Prøvebeholder: Prøvebeholder: Tørt, sterilt plastrør.

FÆCES
Prøvemængde: Max. 5 mL.
Prøvebeholder: Fæcesrør med skruelåg. Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit.

KVINDELIGE GENITALIER
Prøvemateriale: Vaginal- og cervixsekret, cervix- og endometrieskrab.
Prøvemængde: Så meget som muligt.
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør.
Bemærkning: Podepind anbefales ikke, da prøvemængden er for ringe. Pga. variation i udskillelsen af mykobakterier tilrådes at undersøgelse foretages 3 gange nær midten af cyklus. 

LUFTVEJSSEKRET
Prøvemateriale: Ekspektorat, trakeobronkialt sekret, bronkialskyllevæske (BAL).
Prøvemængde: Mindst 5-10 mL.
Prøvetagning: Ekspektorat: Prøven tages helst tidligt om morgenen, spyt og næsesvælgsekret undgås. Ekspektoratet skal opbringes ved "virkelig hoste", dvs. det skal komme nede fra lungerne. Ekspektorat hostes op i steril beholder, og prøvematerialet overføres til SSI i ekspektoratdåse, der anbringes i den gule yderemballage. Prøvetagningen bør udføres udendørs eller i et velventileret rum, da den helt overvejende smittemåde er dråbeinfektion.

Traceobronkialt sekret: Velegnet materiale kan ophentes ved sug gennem kateter eller bronkoskop.

Bronkialskyllevæske (BAL) ophentet ved bronkoskopi: Ved skylning af bronkoskopet før brug skal ubehandlet ledningsvand undgås, da dette kan indeholde mykobakterier, der vanskeliggør påvisning, isolation og resistensbestemmelse af M. tuberculosis complex. Anvend derfor sterilt vand.
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør eller ekspektoratdåse. Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit.
Bemærkninger: Pga. variation i udskillelsen af mykobakterier anbefales internationalt, at der undersøges ekspektorater fra 3 på hinanden følgende dage.

FORMALINFIKSERET, PARAFFININDSTØBT VÆV
Prøvemateriale og prøvemængde: Til analysen skal der indsendes 5 snit á 5 μm formalinfikseret, paraffinindstøbt væv. NB: Laboratoriet har ikke udstyr til at skære 5 μm snit, hvorfor fremsendte klodser returneres.
Prøvebeholder: De 5 snit bedes fremsendt i rør og ikke som mikroskopi præparat. 
Bemærkning: Hurtig påvisning af M. tuberculosis kompleks i histologiske prøver, hvor der er set granulomatøs inflammation men ikke sendt prøvemateriale til dyrkning, og hvor der ikke længere er prøvemateriale tilgængeligt for dyrkning (eller kun svært tilgængeligt). Svartid op til 2-3 hverdage efter prøvens modtagelse.

PUS OG SÅRSEKRET
Prøvemængde: Så meget som muligt aspireres med sprøjte (hvis der kun er en mindre mængde materiale, der ikke kan aspireres, lægges materialet på eSwab med tilhørende plastrør, evt. steril vatpind med et par dråber sterilt vand/saltvand i sterilt rør. 
Prøvebeholder: Aspireret materiale: Tørt, sterilt plastrør.
Prøvematerialet må ikke lægges i formalin eller sprit.

SPINALVÆSKE OG HJERNEVENTRIKELVÆSKE 
Prøvemængde: Så meget som muligt (helst > 2 mL). Muligheden for at påvise mykobakterier stiger med prøvemængden. 
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør.

URIN 
Prøvemateriale: Midtstråleurin fra morgenens første vandladning (mykobakterier akkumuleres i blæren i løbet af natten). 
Prøvemængde: Minimum 40 mL fra hver af 3 på hinanden følgende dage. 
Prøvebeholder: Tørt sterilt plastrør.

VENTRIKELSKYLLEVAND
Prøvetagning: Opsaml prøver tidligt om morgenen i 3 på hinanden følgende dage efter faste. En steril slange føres gennem munden ned i ventriklen. 200-300 mL sterilt vand hældes gennem slangen ved hjælp af tragt. Det er vigtigt, at der stadig er vand i slangen. Ventriklen skylles et par gange ved hævertvirkning eller med stor sprøjte, hvorefter skyllevandet opsamles. 
Prøvemængde: Op til 200 mL. 
Prøvebeholder: SSI flaske mærket "TB, ventrikel" emballeret i tilhørende æske. 
Forsendelse: Hurtig forsendelse anbefales. Alternativt neutraliseres prøven med 200 mg (½ knivspids) NaHCO3 ("tvekulsurt natron") pr. 100 mL prøve før forsendelse.

VÆV
Prøvemateriale: Hud, bindevæv, knoglevæv, glandelvæv, pleurabiopsi, obduktionsmateriale mm. Prøvebeholder: Vævsdåse eller tørt sterilt plastrør. Undgå tilsætning af formalin til prøvematerialet.

Rekvirering

Analysen kan rekvireres på følgende blanketter

Af hensyn til korrekt prøveregistrering skal der altid medfølge en korrekt udfyldt rekvisitionsblanket til indsendte prøver. Blanketten kan enten udfyldes elektronisk og printes eller udfyldes i hånden.

Hvis blanketten ikke kan udfyldes elektronisk, så forsøg at åbne i en anden browser.

Den enkelte prøvebeholder skal ligeledes være mærket med unikke numre/mærker som også er angivet på blanketten. Vær opmærksom på at der for svarmodtager skal være angivet en gyldig e-mail, da alle svar sendes elektronisk via e-mail.

Prøvemateriale og anden sygdom anføres af hensyn til valg af optimal forbehandlingsmetode og dyrkningssubstrater.

Emballering, opbevaring og forsendelse

Prøven indesluttes i en robust beskyttelsesbeholder under forsendelsen.

Kan prøven ikke sendes samme dag skal den opbevares på køl (2-8 °C) og sendes hurtigst muligt.

Undtagelse: Blod og knoglemarv bør opbevares ved stuetemperatur eller 35-37 °C indtil afsendelse. Prøven beskyttes mod lys. Hvis prøven forventes at være undervejs i mere end 4 dage, bør den fremsendes på køl.

Svar

Mikroskopi: Ingen, få, en del, eller mange syrefaste stave.
PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse.

Dyrkning: Resultatet gradueres som; ingen vækst eller få, en del eller mange kolonier af <speciesnavn> påvist.

Dyrkningsbaseret resistensbestemmelse: S, I eller R (følsom eller resistent) på det første isolat.

For M. tuberculosis bliver genotypning som oftest foretaget på resistensbestemte isolater.

Svartid

Mikroskopi: Resultatet besvares normalt samme dag prøven modtages, senest næste hverdag/lørdag. Alle positive nyfund forsøges udtelefoneret.

PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse.

Dyrkning/identifikation: Resultatet afsendes, så snart det foreligger. Ved positiv dyrkning som oftest efter ca. 3 uger og ved negativ dyrkning ca. 8 uger efter prøvens modtagelse.

Alle nyfund af M. tuberculosis kompleks forsøges udtelefoneret. Anfør direkte (bemandet) telefonnummer på rekvisition.

Dyrkningsbaseret resistensbestemmelse: Skriftligt typisk 10-14 dage efter isolation af tilstrækkelig og ren vækst af mykobakterier. Alle nyfund af multiresistent (rifampicin og isoniazid resistent) tuberkulose udtelefoneres, se genotypisk resistensbestemmelse ovenfor.

Epidemiologisk typning med MIRU-VNTR: Resultatet foreligger normalt ca. 3 uger efter isolation af mykobakterier tilhørende M. tuberculosis kompleks.

Tolkning og reference-værdier/interval

Mikroskopi: Sensitiviteten er ca. 60% sammenlignet med dyrkning af mykobakterier. Negativ mikroskopi udelukker derfor ikke forekomst af mykobakterier. Specificiteten er > 99% for Mycobacterium genus. Positivt resultat viser tilstedeværelse af levende eller døde mykobakterier i prøven, men ikke arten. Ved fund af syrefaste stave i luftvejsprøver fra en ubehandlet tuberkulosepatient, anses patienten for smittefarlig. Efter behandlingsstart kan der i flere måneder forekomme døde mykobakterier i kontrolprøver. Undersøgelsen har derfor, i modsætning til dyrkning, begrænset værdi til kontrol af behandlingseffekt.

PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse.

Dyrkning: Sensitiviteten er høj, men negativt resultat udelukker ikke infektion med mykobakterier. Sensitiviteten øges med antallet af undersøgte prøver. Derfor anbefales i Danmark 3 prøver. Ved positivt resultat afspejler antallet af kolonier prøvens indhold af levende mykobakterier. Undersøgelsen er derfor, i modsætning til PCR, egnet til kontrol af behandlingseffekt.

Artsbestemmelsen: Er vejledende for behandlingen.
Fund af arter tilhørende M. tuberculosis kompleks er normalt patologisk og bør medføre behandling. Fund af andre arter kan være patologisk, afhængig af art, bakterieantal, lokalisation og øvrige kliniske og parakliniske fund. Se evt. American Thoracic Society guidelines.

Dyrkningsbaseret resistensbestemmelse: Graden af resistens angives som følsom eller resistent vurderet ud fra kritiske koncentrationer af det pågældende stof.

Epidemiologisk typning: Anvendes til at følge tuberkulosesituationen i Danmark samt til smitteopsporing ved samfundserhvervet, erhvervsbetinget eller nosokomiel tuberkulose. DNA genotypen for det aktuelle isolat sammenlignes med genotyper fra andre patienter. Identiske genotyper i flere patienters isolater indikerer, at patienterne kan tilhøre samme smittekæde.

Bemærkning

Mycobacterium tuberculosis kompleks indeholder M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii, M. caprae og M. pinnipedii.

Referencer: 

Læs mere om Tuberkulose.

Analysens princip

Undersøgelsen indeholder flere analyser. Før disse bliver udført, bliver de fleste prøver forbehandlet med NaOH for at homogenisere og opkoncentrere prøven og for at dekontaminere og herved mindske risikoen for overvækst af uvedkommmende bakterier og svampe. Mikroskopi af syre-alkohol-farvet præparat, PCR og dyrkning laves efterfølgende. Ved positiv PCR og/eller vækst bliver isolatet artsbestemt med forskellige molekylærbiologiske og genotypiske metoder. På M. tuberculosis kompleks udføres i Danmark resistensbestemmelse og epidemiologisk genotypning, mens øvrige mykobakterier bliver undersøgt på forskellige vis, se nedenfor.

Fluorescensmikroskopi: Udføres efter farvning med auramin/rhodamin og affarvning med syre og alkohol.

PCR for M. tuberculosis kompleks inklusive genotypisk resistensbestemmelse.

Dyrkning: Udføres på specialsubstrater afhængigt af prøvematerialet. Alle prøver dyrkes i et automatiseret dyrkningssystem, som aflæses en gang i timen. Formalinfikseret, paraffinindstøbt væv kan ikke dyrkes.

Artsbestemmelse: Udføres i flere trin. De hyppigst forekommende arter identificeres ved genamplifikation efterfulgt af hybridisering til artsspecifikke prober. Yderligere fysiologiske tests eller sekventering kan være påkrævet. Artsbestemmelse udføres normalt på isolatet fra patientens første dyrkningspositive prøve, og på efterfølgende isolater, der formodes at tilhøre en anden art. Udføres desuden ved positivt dyrkningsfund > 1 år efter seneste artsbestemmelse samt lejlighedsvist på mikroskopi positive primære prøver.

Resistensbestemmelse: M. tuberculosis kompleks udføres normalt vha. PCR, når der er DNA nok, og på det første isolat og efterfølgende hver 3. måned, så længe patientens prøver er dyrkningspositive. Yderligere resistensbestemmelser kan rekvireres. Resistensforhold bestemmes primær over for følgende stoffer: ethambutol, rifampicin, isoniazid og pyrazinamid. Ved resistens udføres supplerende resistensundersøgelser for 2nd line stoffer.

Resistensbestemmelse hurtigvoksende mykobakterier (fx M. abscessus, M. fortuitum, M. mucogenicum, og M. peregrinum) udføres normalt på det første isolat og en gang årligt derefter. Yderligere resistensbestemmelser kan rekvireres. Undersøgelsen udføres ved MIC-bestemmelse for bla. clarithromycin, amikacin, moxifloxacin, doxycyclin, sulfatrim, linezolid og tigecyclin.

Resistensbestemmelse langsomtvoksende mykobakterier (fx M. avium, M. intracellulare, M. malmoense og M. xenopi) udføres ikke rutinemæssigt, da der generelt er usikker korrelation mellem resistensbestemmelse og behandlingseffekt (dog undtaget makrolider). Ved tidligere makrolidbehandling eller recidiv under behandling med makrolider kan resistensbestemmelse rekvireres. 

Resistensbestemmelse foretages i første omgang over for clarithromycin (flere koncentrationer). I tillæg kan også resitensbestemmes over for bla. ethambutol, amikacin, rifabutin, ofloxacin og moxifloxacin bestilles.

Epidemiologisk typning: Foretages ved MIRU-VNTR i 24 loci. Analysen udføres normalt på det første M. tuberculosis kompleks isolat samt ved recidiv - normalt uden beregning i Danmark.

Synonym

Mykobakterier, standardundersøgelse

Akkreditering

DANAK logo   Undersøgelsen er akkrediteret af DANAK efter ISO 17025.

Mikroskopi, dyrkning og artsbestemmelse af de hyppigste mykobakteriearter samt resistensbestemmelse af M. tuberculosis kompleks for 1. valgs stoffer er ISO17025 akkrediteret af DANAK under registreringsnummer 397 til prøvning.

Henvendelse

Tuberkulose og Mykobakterier
Veterinær Diagnostik, TB

T. 3268 8600
@. tuberkulose@ssi.dk

Telefontid:
Mandag-torsdag kl. 8.00-15.30
Fredag kl. 8.00-15.00